Data ostatniaj aktualizacji:
20-09-2013

Amfoterycyna B   Inne badania   Laboratorium   Sesja posterowa

Amfoterycyna B

Główne cele badawcze

Celem moich badań jest wyjaśnienie mechanizmów agregacji Amfoterycyny B (AmB) w błonach lipidowych zawierających sterole (cholesterol i ergosterol). Poznanie przyczyn selektywności antybiotyku w stosunku do błon lipidowych zawierających ergosterol ma ogromne znaczenie dla badań prowadzących do zmniejszenia toksyczności AmB. W badaniach organizacji molekularnej AmB w monowarstwach, wielowarstwach i roztworach stosuję następujące techniki: warstw jednocząsteczkowych wraz z metodą Langmuira-Blodgett nanoszenia próbek na podłoże stałe, elektronowej spektroskopii absorpcyjnej z dichroizmem liniowym, spektroskopii fluorescencyjnej z rezonansowym rozpraszaniem światła (RLS), spektroskopii w podczerwieni ATR-FTIR z dichroizmem liniowym.

Amfoterycyna B (AmB) to przeciwgrzybiczy makrolidowy antybiotyk jonoforowy z grupy polienów (Rys. 1A). Strukturę oraz jej budowę przestrzenną ustalono w roku 1970 [1]. Liczne prace naukowe, publikowane na przestrzeni ostatnich lat, dotyczące właściwości farmakologicznych i klinicznych efektów leczniczych oraz toksyczności, świadczą o znaczeniu tego leku we współczesnej medycynie [1-8]. Makrolidowe antybiotyki polienowe to grupa związków biologicznie czynnych, zbudowanych z wieloczłonowych pierścieni z fragmentem polienowym, zamkniętym najczęściej wiązaniem laktonowym. AmB jako metabolit Streptomyces nodosus rozpoznaje oraz niszczy błony lipidowe należące do grzybów. Błony te zawierają ergosterol, który podobnie jak cholesterol pełni rolę stabilizacyjną, modyfikując właściwości dynamiczne i strukturalne błony komórkowej (Rys. 1, B i C). AmB wykazuje lepszą selektywność w stosunku do błon zawierających ergosterol niż cholesterol [9-19]. Brak steroli w błonach bakterii ogranicza działanie AmB wobec tych drobnoustrojów [20, 21]. Właściwość ta umożliwia stosowanie leku do zwalczania głębokich infekcji grzybiczych w organizmie człowieka.
Stosowanie AmB w leczeniu ostrych grzybic narządów wewnętrznych występujących w następstwie AIDS [22] oraz po transplantacji organów wewnętrznych przeżywa obecnie swój renesans [1]. W organizmie człowieka AmB wywołuje także wiele skutków ubocznych takich jak np. działanie nefrotoksyczne. W związku z tym preparat przy ostrej niewydolności nerek podaje się tylko w przypadku zagrożenia życia [23, 24]. Dodatkowo, AmB wykazuje działanie hepatotoksyczne, przy wyższych dawkach także neurotoksyczne i hemolityczne [25]. Jako jedną z przyczyn rozpadu erytrocytów podaje się zdolność tworzenia kompleksów AmB z jonami miedzi Cu2+ [26].
Przypuszcza się, że toksyczność AmB oddziaływującej ze sterolami błony lipidowej komórki polega na tworzeniu w niej agregatów molekularnych w formie porów, zaburzających fizjologiczny transport jonów (K+, Na+, H+, Cl-), co w konsekwencji prowadzi do śmierci komórki. W celu zmniejszenia toksyczności, AmB jest używana również w połączeniu z deoksycholanem sodu w preparacie Fungizon, co daje mniejsze efekty uboczne leku [27]. Dążąc do zmniejszenia toksyczności prowadzi się modyfikacje chemiczne polienów naturalnych takie jak: ester metylowy AmB i D-ornityloamfoterycynę B [28]. Opracowano także na bazie AmB formułę AMA (B3-N’-dimetylaminopropyl amid) [29-33]. Częściowe zmniejszenie toksyczności AmB osiągnięto na drodze nowej technologii połączenia lipidów z AmB. Liposomalna amfoterycyna B (AmBisome®), [34-38] płaskie lipidowe membrany (Ablect®) lub dyski (Amphocil, Amphotec nasycone AmB są mniej toksyczne niż stosowane wcześniej inne farmaceutyki z AmB [39-41].
[Rozmiar: 36154 bajtów]

Rys. 1. Struktury chemiczne cząsteczek: AmB (A), cholesterolu (B) oraz ergosterolu (C).

Badania prowadzone z zastosowaniem techniki warstw jednocząsteczkowych oraz mikroskopii sił atomowych (AFM) dostarczyły informacji o aspektach oddziaływania międzymolekularnego cząsteczek AmB. Analiza topografii powierzchni monowarstw techniką AFM pozwoliła określić struktury porów antybiotyku uformowanych w obecności lipidu [42, 43]. Molekularne struktury tworzone przez AmB odgrywają kluczową rolę w biologicznym działaniu tego leku.

[Rozmiar: 37720 bajtów]
Rys. 2. Obraz AFM powierzchni monowarstwy AmB naniesionej na kryształ miki przy ciśnieniu powierzchniowym 25 mN/m. Skład monowarstw to 90 %mol AmB i 10 %mol DPPC. Próbkę naniesiono na powierzchnię kryształu metodą Langmuira - Blodgett. Zakres zmian głębokości (z) wynosi 0.3 nm. Wymiary powierzchni skanu 20 x 20 Å [42, 43].

Wewnętrzna średnica poru zaprezentowanego na Rys. 2 (w oparciu o mikroskopię AFM) wynosi 6 Å a zewnętrzna 17 Å. Obliczone wartości odpowiadają rozmiarom uzyskanym z teorii rozszczepienia ekscytonowego. Najbardziej prawdopodobną liczbą cząsteczek budujących por (N = 8) [44].

Teoria rozszczepienia ekscytonowego

Głównym założeniem teorii rozszczepienia ekscytonowego jest możliwość zapisu energii oddziaływania dwóch cząsteczek przez oddziaływanie ich dipolowych momentów przejść. W celu obliczenia przejść elektronowych w oddziałujących cząsteczkach uwzględnia się tylko pojedyncze stany wzbudzone. Dimery cząsteczek tworzone są poprzez oddziaływanie pary sąsiadujących monomerów (Rys. 3), prowadzi to do przesunięcia i rozszczepienia pasma absorpcji (Rys. 4). Przesunięcie maksimum absorpcji opisywane jest zależnością (1) [7, 8, 45].
[Rozmiar: 4716 bajtów]
Gdzie [Rozmiar: 178 bajtów] - oznacza energię stanu wzbudzonego w widmie agregatu, [Rozmiar: 173 bajtów] - energię stanu wzbudzonego w widmie monomeru, N – liczbę cząsteczek formujących agregat, [Rozmiar: 184 bajtów] - energię oddziaływania dipol–dipol, m – numer poziomu ekscytonowego. Dla przesunięcia w stronę fal krótszych m = 1 dla form dimerów i N-agregatów, natomiast w stronę fal dłuższych m = 2 dla form dimerów a m=M dla N-agregatów (Rys. 4).
[Rozmiar: 9247 bajtów]
Rys. 3. Orientacja dipolowych momentów przejść [Rozmiar: 1145 bajtów] i [Rozmiar: 1166 bajtów] i cząsteczek w dimerze , [Rozmiar: 1170 bajtów], [Rozmiar: 1252 bajtów] kąty pomiędzy dipolowymi momentami przejść a osią łączącą ich środki, [Rozmiar: 1066 bajtów] -kąt pomiędzy dipolowymi momentami przejść, [Rozmiar: 1269 bajtów]- odległość między środkami chromoforów.

Wielkość [Rozmiar: 189 bajtów] opisana jest zależnością (2) wynikającą bezpośrednio z energii oddziaływań dipol-dipol, dlatego dla przesunięcia w stronę fal krótszych [Rozmiar: 189 bajtów] > 0, natomiast w stronę fal dłuższych [Rozmiar: 189 bajtów] < 0.

Rozmiar: 1703 bajtów
W wyniku przekształceń można zależność (2) przedstawić w postaci wzoru (3) z którego można wyznaczyć odległość między sąsiednimi chromoforami [Rozmiar: 1269 bajtów].

[Rozmiar: 1946 bajtów]

[Rozmiar: 204 bajtów] dipolowy moment przejścia monomeru, [Rozmiar: 164 bajtów] przenikalność dielektryczna próżni, [Rozmiar: 149 bajtów]-współczynnik załamania światła w badanym ośrodku (np. dla błony lipidowej z DPPC przyjmujemy 1.44), [Rozmiar: 1269 bajtów] - odległość między sąsiadującymi chromoforami agregujących cząsteczek AmB. Dipolowy moment przejścia monomeru AmB obliczony z integracji widma absorpcji [Rozmiar: 204 bajtów] = 11.3 Debye. Dla ułożenia cząsteczek w agregatach tupu „card pack” [Rozmiar: 147 bajtów] = 1 natomiast dla agregatów typu „head to tail” [Rozmiar: 147 bajtów] = -2.

Agregacja cząsteczek AmB związana z ich oddziaływaniem znajduje swoje odbicie w zmianach spektralnych w widmie absorpcji [42, 44, 46]. Zmiany spektralne związane z agregacją cząsteczek można jakościowo wyjaśnić za pomocą klasycznego oddziaływania między dipolowymi momentami przejść optycznych w każdej z cząsteczek. W celu wyjaśnienia, z jakimi możliwymi orientacjami momentów przejść możemy mieć do czynienia w agregacie molekularnym, należy skorzystać z reguły opisanej przez Kashę [7, 8]. Zakłada ona, że w przypadku orientacji dipolowych momentów przejść związanej z odpychaniem się dipoli elektrycznych następuje przesunięcie poziomu wzbudzonego w stronę wyższych energii (przesunięcie niebieskie określane często dla form agregatów typu „card pack” (talia kart)). Przyciąganie dipoli elektrycznych wpływa na przesunięcie poziomu wzbudzonego w stronę niższych energii (przesunięcie czerwone określane często dla form agregatów typu „head to tail” (głowa do ogona)). Gdy suma wektorowa dipoli elektrycznych jest równa zeru wtedy przejścia są wzbronione, co wiąże się z obniżeniem energii wzbudzenia. Na podstawie powyższych rozważań można przedstawić struktury pasm ekscytonowych dimerów przy różnych orientacjach dipolowych momentów przejść, Rys. 4.

Rozmiar: 36131 bajtów
Rozmiar: 9814 bajtów

Rys. 4. Struktury pasm ekscytonowych dla dimerów AmB typów: „card pack” (A), „head to tail” (B), ukośnej (C) oraz N-agregatów (D). Liniami przerywanymi oznaczono przejścia zabronione natomiast ciągłymi przejścia dozwolone.

Sposób agregacji cząsteczek przedstawiony powyżej jest znacznie uproszczony w porównaniu do rzeczywistych typów agregatów, stąd też przesunięcia spektralne nie zawsze może być związane z przedstawioną powyżej teorią. Istnieje, co najmniej kilka sugestii związanych z przesunięciem spektralnym widm absorpcji, które obok oddziaływania ekscytonowego mogą być związane np. z solwatochromizmem i oddziaływaniami wiązań wodorowych. W świetle badań spektroskopii absorpcyjnej UV-Vis agregacja AmB w błonach lipidowych związana jest z hipsochromowym przesunięciem maksimum absorpcji z 408 nm dla formy monomerycznej AmB w mieszaninie rozpuszczalników 2-propanol:woda (4:6, v:v), na 350 nm, forma zagregowana w liposomach z lecytyny dwupalmitynowej (DPPC) w stężeniu 5 % molowych AmB w DPPC, co przedstawia Rys. 5.

[Rozmiar: 43500 bajtów]

Rys. 5 Widma absorpcji elektronowej charakterystyczne dla monomeru AmB (linia niebieska) w mieszaninie rozpuszczalników 2-propanol:woda (4:6, v:v), oraz formy zagregowanej antybiotyku (linia czerwona) w stężeniu 5 % molowych AmB w DPPC. Przesunięcie spektralne [Rozmiar: 226 bajtów] (z 408 na 350 nm, należy przeliczyć na cm-1) związane jest z agregacją AmB.



Bibliografia

  1. S. Hartsel, J. Bolard, Amphotericin B: new live for an old drug, TiPS 17 (1996).
  2. H.A. Gallis, R.H. Drew, W.W. Pickard, Amphotericin B: 30 years of clinical experience, Rev Infect Dis 12 (1990) 308-329.
  3. S.C. Hartsel, C. Hatch, W. Ayenew, How does amphotericin B work?: Studies on model membrane systems, J. Liposome Res. 3 (1993) 377-408.
  4. J. Brajtburg, W.G. Powderly, G.S. Kobayashi, G. Medoff, Amphotericin B: current understanding of mechanisms of action, Antimicrob. Agents Chemother. 34 (1990) 183-188.
  5. R. Agarwal, N. Singh, Amphotericin B is still the drug of choice for invasive aspergillosis, Am J Respir Crit Care Med 174 (2006) 102.
  6. M. Kleinberg, What is the current and future status of conventional amphotericin B?, Int J Antimicrob Agents 27 Suppl 1 (2006) 12-16.
  7. M. Kasha, Energy Transfer Mechanisms and the Molecular Exciton Model for Molecular Aggregates, Radiat Res 20 (1963) 55-71.
  8. M. Kasha, H.R. Rawls, M. Ashraf El-Bayoumi, The exciton model in molecular spectroscopy, Pure Appl. Chem. 11 (1965) 371-392.
  9. E.B. Cohen, Concentration- and time-dependence of amphotericin B induced permeability changes across ergosterol-containing liposomes, Biochim. Biophys. Acta 857 (1986) 117-122.
  10. M. Gagoś, J. Gabrielska, M. Dalla Serra, W.I. Gruszecki, Binding of antibiotic amphotericin B to lipid membranes: monomolecular layer technique and linear dichroism-FTIR studies, Mol Membr Biol 22 (2005) 433-442.
  11. J. Gabrielska, M. Gagoś, J. Gubernator, W.I. Gruszecki, Binding of antibiotic amphotericin B to lipid membranes: a 1H NMR study, FEBS Lett 580 (2006) 2677-2685.
  12. P. Dynarowicz-Latka, R. Seoane, J. Minones Jr., M. Velo, J. Minones, Study of penetration of amphotericin B into cholesterol or ergosterol containing dipalmitoyl phosphatidylcholine Langmuir monolayers, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 27 (2002) 249-263.
  13. J. Barwicz, P. Tancrede, The effect of aggregation state of amphotericin-B on its interactions with cholesterol- or ergosterol-containing phosphatidylcholine monolayers, Chem. Phys. Lipids 85 (1997) 145-155.
  14. S. Matsuoka, M. Murata, Cholesterol markedly reduces ion permeability induced by membrane - bound amphotericin B, Biochim Biophys Acta 1564 (2002) 429-434.
  15. C. Charbonneau, I. Fournier, S. Dufresne, J. Barwicz, P. Tancrede, The interactions of amphotericin B with various sterols in relation to its possible use in anticancer therapy, Biophys Chem 91 (2001) 125-133.
  16. J. Bolard, P. Legrand, F. Heitz, B. Cybulska, One-Sided Action of Amphotericin B on Cholesterol-Containing Membranes Is Determined by Its self-Association in the Medium, Biochemistry 30 (1991) 5707-5715.
  17. M. Baginski, A. Tempczyk, E. Borowski, Comparative conformational analysis of cholesterol and ergosterol by molecular mechanics, Eur Biophys J 17 (1989) 159-166.
  18. M. Baginski, H. Resat, E. Borowski, Comparative molecular dynamics simulations of amphotericin B-cholesterol/ergosterol membrane channels, Biochim Biophys Acta 1567 (2002) 63-78.
  19. T.E. Andreoli, On the anatomy of amphotericin B-cholesterol pores in lipid bilayer membranes, Kidney Int 4 (1973) 337-345.
  20. B.J. Backes, S.D. Rychnovski, A reverse-phase HPLC assay for measuring the interaction of polyene macrolide antifungal agents with sterols, Anal. Biochem. 205 (1992) 96-99.
  21. J. Brajtburg, J. Bolard, Carrier effects on biological activity of amphotericin B, Clinical Microbiology Reviews 9 (1996) 512-&.
  22. K. Konopka, L.S.S. Guo, N. Duzgunes, Anti-HIV activity of amphotericin B-cholesteryl sulfate colloidal dispersion in vitro, Antivir. Res. 42 (1999) 197-209.
  23. M. LeBrun, L. Grenier, P. Gourde, M.G. Bergeron, G. Labrecque, D. Beauchamp, Nephrotoxicity of amphotericin B in rats: effects of the time of administration, Life Sci 58 (1996) 869-876.
  24. S. Harbarth, S.L. Pestotnik, J.F. Lloyd, J.P. Burke, M.H. Samore, The epidemiology of nephrotoxicity associated with conventional amphotericin B therapy, Am J Med 111 (2001) 528-534.
  25. S.P. Racis, O.J. Plescia, H.M. Geller, C.P. Schaffner, Comparative toxicities of amphotericin B and its monomethyl ester derivative on glial cells in culture, Antimicrob Agents Chemother 34 (1990) 1360-1365.
  26. J. Bolard, M. Cheron, J. Mazerski, Effect of surface curvature on the interaction of single lamellar phospholipid vesicles with aromatic and nonaromatic heptaene antibiotics (vacidin A and amphotericin B), Biochem Pharmacol 33 (1984) 3675-3680.
  27. I. Gruda, D. Milette, M. Brother, G.S. Kobayashi, G. Medoff, J. Brajtburg, Structure-activity study of inhibition of amphotericin B (Fungizone) binding to sterols, toxicity to cells, and lethality to mice by esters of sucrose, Antimicrob Agents Chemother 35 (1991) 24-28.
  28. B.N. Rogers, M.E. Selsted, S.D. Rychnovsky, Synthesis and biological evaluation of non-polyene analogs of amphotericin B, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 7 (1997).
  29. I. Blanc, M.-H. Bueno Da Costa, J. Bolard, M.S.-P. Chazalet, Oligonucleotide delivery by a cationic derivative of the polene antibiotic amphotericin B :Interaction oligonucleotide/vector as studied by optical spectroscopy and electron microscopy, Biochim. Biophys. Acta 1464 (2000) 299-308.
  30. B. Cybulska, I. Gadomska, J. Mazerski, J.G.E. Borowski, M. Cheron, J. Bolard, N-Methyl-N-D-fructosyl amphotericin B methyl ester (MF-AME), a novel antifungal agent of low toxicity: monomer/micelle control over selective toxicity, Acta Biochim Pol 47 (2000) 121-131.
  31. B. Cybulska, I. Gadomska, J. Mazerski, J. Grzybowska, E. Borowski, M. Cheron, J. Bolard, N-methyl-N-D-fructosyl amphotericin B methyl ester (MF-AME), a novel antifungal agent of low toxicity: Monomer/micelle control over selective toxicity, Acta Biochimica Polonica 47 (2000) 121-131.
  32. J. Szlinder-Richert, B. Cybulska, J. Grzybowska, J. Bolard, E. Borowski, Interaction of amphotericin B and its low toxic derivative, N-methyl-N-D-fructosyl amphotericin B methyl ester, with fungal, mammalian and bacterial cells measured by the energy transfer method, Farmaco 59 (2004) 289-296.
  33. J. Szlinder-Richert, J. Mazerski, B. Cybulska, J. Grzybowska, E. Borowski, MFAME, N-methyl-N-D-fructosyl amphotericin B methyl ester, a new amphotericin B derivative of low toxicity: relationship between self-association and effects on red blood cells, Biochim Biophys Acta 1528 (2001) 15-24.
  34. E.W. van Etten, M. Otte-Lambillion, W. van Vianen, M.T. ten Kate, A.J. Bakker-Woudenberg, Biodistribution of liposomal amphotericin B (AmBisome) and amphotericin B-desoxycholate (Fungizone) in uninfected immunocompetent mice and leucopenic mice infected with Candida albicans, J Antimicrob Chemother 35 (1995) 509-519.
  35. G.W. Boswell, D. Buell, I. Bekersky, AmBisome (liposomal amphotericin B): a comparative review, J Clin Pharmacol 38 (1998) 583-592.
  36. A.C. Leenders, P. Reiss, P. Portegies, K. Clezy, W.C. Hop, J. Hoy, J.C. Borleffs, T. Allworth, R.H. Kauffmann, P. Jones, F.P. Kroon, H.A. Verbrugh, S. de Marie, Liposomal amphotericin B (AmBisome) compared with amphotericin B both followed by oral fluconazole in the treatment of AIDS-associated cryptococcal meningitis, Aids 11 (1997) 1463-1471.
  37. R. Russo, L.C. Nigro, S. Minniti, A. Montineri, L. Gradoni, L. Caldeira, R.N. Davidson, Visceral leishmaniasis in HIV infected patients: treatment with high dose liposomal amphotericin B (AmBisome), J Infect 32 (1996) 133-137.
  38. M. Fukasawa, [Liposomal amphotericin B], Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi 46 (2005) 229-231.
  39. K.V. Clemons, D.A. Stevens, Comparison of fungizone, Amphotec, AmBisome, and Abelcet for treatment of systemic murine cryptococcosis, Antimicrob Agents Chemother 42 (1998) 899-902.
  40. M. Kwong, K.M. Wasan, Cholesteryl ester transfer protein facilitates the movement of water-insoluble drugs between lipoproteins: a novel biological function for a well-characterized lipid transfer protein, Biochem Pharmacol 64 (2002) 1669-1675.
  41. Z. Zhang, R.M. Diener, J.M. Lipman, Safety evaluation of ABELCET, an amphotericin B lipid complex (ABLC): toxicity studies in rats, Int J Toxicol 25 (2006) 285-294.
  42. W.I. Gruszecki, M. Gagoś, M. Herec, P. Kernen, Organization of antibiotic amphotericin B in model lipid membranes. A mini review, Cell. Mol. Biol. Lett. 8 (2003) 161-170.
  43. W.I. Gruszecki, M. Gagoś, P. Kernen, Polyene Antibiotic Amphotericin B in Monomolecular Layers: Spectrophotometric and Scanning Force Microscopic Analysis, FEBS Lett. 524 (2002) 92-96.
  44. M. Gagoś, R. Koper, W.I. Gruszecki, Spectrophotometric analysis of organisation of dipalmitoylphosphatylcholine bilayers containing the polyene antibiotic amphotericin B, Biochim. Biophys. Acta 1511 (2001) 90-98.
  45. J. Parkash, J.H. Robblee, J. Agnew, E. Gibbs, P. Collings, R.F. Pasternack, J.C. de Paula, Depolarized Resonance Light Scattering by Porphyrin and Chlorophyll a Aggregates, Biophys. J. 74 (1998) 2089-2099.
  46. J. Barwicz, W.I. Gruszecki, I. Gruda, Spontaneous Organization of Amphotericin B in Aqueous Medium, J. Colloid Interf. Sci. 158 (1993) 71-76.



Strona główna  |   O mnie (CV)  |   Działalność naukowa  |   Spis publikacji  |   Działalność dydaktyczna  |   Współpraca  |   Projekty badawcze     Recenzje  
All Rights Reserved Mariusz Gagoś statystyka